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超高效液相色谱质谱法检测滩羊宰后成熟过

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羊肉是世界上较重要的动物蛋白质来源,而滩羊是宁夏优势特色畜种,其肉质细嫩鲜美、营养丰富、风味独特。消费者大都根据风味、多汁性和嫩度评价羊肉品质,其中风味是消费者评价肉品质最常用的感官指标。肉在加热过程中,肉中的风味前体物质包括水溶性化合物和脂质发生一系列复杂的反应,如美拉德反应、脂类氧化、氨基酸降解和硫胺素热解生成各种呈味物质,赋予肉以滋味和香味。

代谢组学是分析低分子质量代谢物生物化学过程的研究,对代谢物进行定性或定量及探讨代谢物在生物体生物系统中的变化。食品代谢组学中几种常用的分析方法包括核磁共振光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LCMS)。针对肉中呈味核苷酸及其他非挥发性风味物质多采用高效液相色谱法分析,而LC-MS技术为代谢组学分析中较成熟的技术之一,其样本前处理较为简单,并且检测到的代谢物多为有机酸、氨基酸、核苷酸及某些脂类。但目前采用LC-MS系统分析宰后成熟期间肉类风味物质变化的研究报道较少。

宁夏大学农学院的尤丽琴、罗瑞明*和苑昱东等人以滩羊宰后背最长肌为研究对象,采用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)法分析宰后肌肉在4℃成熟期间与风味物质相关的代谢物种类和相对含量的变化,通过代谢途径的映射,进一步探讨滩羊肉成熟过程中风味物质前体、中间体代谢过程及其调控机制,为滩羊肉生产中风味控制技术提供理论指导。

1.多元统计分析

将所得数据矩阵导入SIMCA14.0软件进行模式识别,采用非监督类的模式识别方法PCA和监督模式识别方法OPLS-DA对滩羊肉UPLC-MS代谢指纹峰组内和组间样品进行识别。在PCA得分图中,每个点代表一个独立的样品,图1A显示样品在95%置信区间且组间分离程度良好,表明成熟时间对滩羊肉代谢存在差异。在PCA模型基础上,采用OPLS-DA模型进一步分析成熟对滩羊肉代谢模式影响,继而筛选差异代谢物,由图1B可知,模型的可解释变量(R2X)分别为0.和0.,模型的可预测度(Q2)分别为0.和0.,说明该模型能很好地解释和预测两组样本之间的差异。采用7次循环交互验证和次响应排序检验的方法检验模型的质量,由图1C可知,截距值R2分别为0.和0.,Q2分别为-0.和-0.,体现了模型的可靠性,说明基于UPLC-MS建立的OPLS-DA模型用于滩羊肉成熟期各组之间的差异是可信的。

2.差异代谢物筛选和鉴定

采用多维分析和单维分析相结合的办法,筛选组间差异代谢物,筛选标准为OPLS-DA模型PC1的VIP值大于1.2、t检验的P值小于0.05和离子质量测量准确度值小于10×10―6。根据OSI/SMMS软件结合HMDB和METLIN数据库鉴定代谢物,结果显示,滩羊肉4℃冷藏成熟过程中主要的代谢物种类有氨基酸类及其衍生物、有机酸类、碳水化合物及其代谢物、脂质、核酸及其衍生物和辅因子。

在本研究中滩羊肉4℃冷藏成熟期间碳水化合物和有机酸类在4d组和0d组中差异显著,赋予肌肉甜味和酸味特征,而成熟8d游离氨基酸及其衍生物、脂类和核酸及其衍生物差异较显著且含量明显增加,使肌肉中风味特征更加丰富。生肉中风味前体物质可能潜在影响羊肉加工中风味物质的形成,因此在冷鲜羊肉加工时应控制和合理选择最佳成熟期,以保证产品风味。

3.差异代谢物变化分析

图2为UPLC-MS分析鉴定出滩羊肉冷藏成熟期间23种差异代谢物的相对含量变化,0d组样品中腺苷二磷酸、DL-乳酸、D-赤藓糖-4-磷酸、肌苷酸、戊烯二酸单酰辅酶A、DL-苹果酸、D-核酮糖-5-磷酸、不对称二甲基精氨酸和DL-7-羟基硬脂酸相对含量较高。成熟4d时,样品中N-乙酰基-L-蛋氨酸、组氨精氨酸、L-苯丙氨酸、哌啶、柠檬酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、肌苷和D-苯丙氨酸相对含量较高。而成熟第8天,大多数氨基酸及其衍生物、脂质和核酸及其衍生物相对含量较第4天时增加,其中组氨精氨酸、β-柠檬酰基-L-谷氨酸、D-苯丙氨酸、哌啶、肌苷和二十碳五烯酸相对含量显著增加。本研究显示IMP含量在成熟第4天时下降,表明成熟前期IMP已出现降解,成熟后期肌苷含量的增加也证明在成熟第8天时仍有足够的IMP进一步降解。生肉中的风味前体无论是在美拉德反应中还是作为美拉德反应的前体,对煮熟的肉类风味都有贡献。肉中脂质组成和脂肪酸的含量是影响肉和肉制品风味的因素之一,脂肪酸是蒸煮肉中挥发性风味物质重要的前体物,肌内脂肪中含有大量不饱和脂肪酸,其中二十碳五烯酸可以抑制酸味和苦味,增加甜味和鲜味特征,本研究中滩羊肉成熟第8天时二十碳五烯酸相对含量显著增加。结果表明,随着成熟时间的延长,滩羊背最长肌中核苷酸降解物、碳水化合物以及游离氨基酸等呈味物质含量随之增加,滩羊肉4℃冷藏成熟第8天时风味前体物质的总体水平较高,因此宰后成熟工艺有利于滩羊肉风味的改善。

4.关键代谢通路分析

将分析得到的差异代谢物映射到KEGG数据库进行代谢途径分析,结果显示,在冷藏成熟过程中关键的代谢途径为戊糖磷酸代谢、三羧酸循环、氨基酸合成和嘌呤代谢。基于KEGG代谢通路图,将关键代谢通路和差异代谢物相互关联,整合分析结果见图3。动物屠宰后肌肉处于厌氧状态糖酵解途径增强,ATP含量下降,导致肉中核苷酸减少和乳酸积累,此阶段肉风味较差。在成熟早期,由于糖原供应不足,木酮糖磷酸-3-差向异构酶和核酮糖-磷酸-3-差向异构酶活性减弱,使D-赤藓糖-4-磷酸和D-核酮糖-5-磷酸含量降低。为维持肌肉细胞持有的生化过程,ATP在一系列腺苷酸激酶和AMP脱氨酶的作用下生成IMP,此阶段肉质柔嫩多汁,风味较好。在成熟后期,IMP在肌苷激酶的作用下进一步降解为肌苷。

随着成熟的延长,糖酵解所生成的丙酮酸不仅在一些辅酶的作用下,参与脂肪、蛋白质等物质的代谢,进一步生成脂肪酸和游离氨基酸,也可以进入三羧酸循环,在此苹果酸通过苹果酸脱氢酶转化为草酰乙酸,柠檬酸在草酰乙酸和乙酰辅酶A的缩合下含量增加,此阶段肉中呈味物质较多,肉质风味更加丰富。综上所述,整合图中包含了关键代谢通路、代谢物及相关酶的关联信息,以便理解滩羊肉成熟过程中风味前体物质变化的调控机理。

结论

为系统分析成熟对滩羊肌肉代谢物及代谢通路的影响。本研究采用UPLC-MS代谢组学方法研究成熟过程对滩羊宰后背最长肌中内源性小分子物质代谢的影响,鉴定出23种差异代谢物,包括7种氨基酸及其衍生物、2种碳水化合物及其代谢物、3种有机酸类、5种脂质类、5种核酸及其衍生物和1种辅因子。从不同成熟期差异代谢物种类和含量的对比分析得出,随着成熟时间的延长,差异代谢物中风味特征物质种类和含量总体水平显著增加,从而滩羊肉的风味特征更为丰富。代谢通路分析显示,戊糖磷酸代谢、三羧酸循环、氨基酸合成和嘌呤代谢在滩羊宰后成熟期间风味前体物质形成中起主要调节作用。研究结果可为滩羊肉生产中风味形成控制技术提供理论指导。

本文《超高效液相色谱-质谱法检测滩羊宰后成熟过程中风味前体物质的变化》来源于《食品科学》年41卷8期-页,作者:尤丽琴,罗瑞明,苑昱东,李子欣。DOI:10./spkx---。点击下阅读原文即可查看文章相关信息。

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